Аннотация
Задача исследования механобиологии в реальном времени
В сложном танце между патогенами и человеческим организмом механические факторы оказывают значительное влияние, определяя экспрессию генов, динамику адгезии и даже морфогенез. От плотности внеклеточного матрикса, сдвиговых сил потока жидкости в мочевыводящих путях или извилистости кровеносных сосудов - область механобиологии переплетается с фундаментальными биологическими процессами. Однако фиксация этой динамики в реальном времени, особенно в сложных микросредах, таких как кишечник, остается сложной задачей, поскольку конфокальные микроскопы слишком медленны для изображения перистальтических движений [A. Boquet-Pujadas et al., 2022].
Модели «кишечник-на-чипе»
Развитие технологии Organ-on-a-Chip (OoC), в которой миниатюрные экосистемы воспроизводят физиологические условия с поразительной точностью, открыло новые возможности для изучения механобиологических явлений, особенно для патологий, присущих исключительно человеку и не воспроизводимых на животных моделях. Благодаря интеграции различных типов клеток и пористых мембран, способствующих поддержанию гомеостатических условий, платформы OoC имитируют микроархитектуру органов, при этом внедряя такие важные элементы, как поток и перистальтика. Однако поиск всеобъемлющих знаний сталкивается с трудностями, особенно в получении 3D-изображений в реальном времени и изучении переходных процессов.
В исследовании рассматриваются механизмы вторжения двух патогенов:
Амеба entamoeba histolytica (ответственна за амебиаз)
Амебиаз возникает из-за присутствия амебы Entamoeba histolytica, паразита, который поражает исключительно человека. Хотя многие инфекции протекают бессимптомно, как только паразит проникает в кишечник, он может вызвать болезненную диарею, сопровождающуюся кровью и образованием язв. В тяжелых случаях амебиаз может привести к образованию абсцессов в жизненно важных органах, таких как печень, легкие и мозг.
Рисунок 1. Entamoeba histolytica, выделенная красным цветом, разрушает слой слизи в толстой кишке человека, сканирующая электронная микроскопия (Институт Пастера)
Бактерии shigella flexneri (вызывают шигеллез)
Шигеллез возникает в результате заражения бактериями Shigella, которые являются отдельными разновидностями кишечной палочки. Эти бактерии несут в себе плазмиду вирулентности, что позволяет им проникать только в эпителиальные клетки кишечника человека, а затем и в слизистую оболочку. Эта инвазия вызывает значительное воспаление, сопровождающееся обширным повреждением тканей.
Рисунок 2. Shigella flexneri, инвазирующая эпителиальные клетки кишечника человека, сканирующая электронная микроскопия (Institut Pasteur).
Цель исследования
Целью данной работы было создание 4D-изображения живых тканей «органов-на-чипе» при циклической деформации, зеркально отражающей перистальтические движения кишечника. Помимо визуализации, этот подход позволяет выявить реологию тканей, предлагая новый взгляд на пространственно-временное распределение механического напряжения. Сфокусировавшись на энтеральном барьере, исследование представляет взаимодействие между механическими сигналами и патогенными атаками, выделяя механизмы вирулентности E. histolytica и S. flexneri.
Наблюдались различные параметры: гибель клеток хозяина, связность тканей, отслеживание патогенов, проникновение и колонизация, а также корреляция со стрессом.
Схема эксперимента
Материалы:
- Кишечник на чипе (эмульсия)
- Конфокальный микроскоп T2i с вращающимся диском (Nikon)
- Цифровая C"> ORCA-Flash 4.0 (Hamamatsu)
- Контроллер потока OB1 MK3+ (Elveflow)
- Датчик потока MSF (Elveflow)
- Программный интерфейс Elveflow (Elveflow).
Рисунок 3. Схема сквозного рабочего процесса от культуры клеток до анализа данных.
Оптимизация 4D-видеосъемки в реальном времени
Прежде всего, получение видео в условиях перистальтики представляет собой несколько проблем, которые были решены в данном исследовании:
- Выравнивание: Последовательности часто расходятся по фазе с циклическими перистальтическими движениями. Для решения этой проблемы необходимо выравнивание в 4D-стеки с учетом временной задержки между циклами.
- Кривизна ткани: Кривизна тканей может привести к расфокусировке изображений, что требует использования 2D-проекции.
- Коррекция движения: Могут возникать смещения вне плоскости, что требует применения методов коррекции движения для обеспечения точности изображения.
Инфекция в кишечнике на чипе
Кишечник-на-чипе, разработанный компанией Emulate, состоит из двух камер (как было представлено в их предыдущей работе [A. Grassart et al., 2019]). Верхняя камера перфузируется культуральной средой и содержит культивированные клетки Caco2, в то время как нижняя камера предназначена исключительно для перфузии культуральной среды. Поперечная мембрана обеспечивает механическое растяжение для имитации перистальтического движения. Бактерии и амебоидная инфекция были получены путем введения инфицированных культур в систему.
Микрофлюидная перистальтическая установка для измерения напряжения
Микрофлюидная установка контролировалась с помощью программного обеспечения ESI от Elveflow и контроллера давления OB1 на установке из 3 каналов (см. рис. 4):
- Канал 1: перфузия среды в верхний канал чипа кишечника, содержащего клетки Caco2 (эпителий из толстой кишки человека). Сопряжен с MSF FLOW SENSOR (30 мкл/час).
- Канал 2: перфузия среды в нижний канал кишечного чипа. Сопряжен с MSF FLOW SENSOR (30 мкл/час).
- Канал 3: Боковое вакуумное растяжение для воспроизведения перистальтики толстой кишки (величина 10 % на частоте 0,15 Гц).
Рисунок 4. Микрофлюидная установка Elveflow с Emulate Gut-on-chip для воспроизведения перистальтических движений.
Основные выводы
Примечания к контрольным параметрам эксперимента: WP: с перистальтикой-растяжением; WOP: без перистальтики-растяжения; Shigella-mxiD: авирулентный штамм; штамм шигеллы TSAR экспрессировал GFP при активации T3SS (маркер индукции генов вирулентности, позволяющий проникать в клетки хозяина); ингибитор цистеиновых протеаз (E64) препятствует активности деградации клеточных мембран амебы.
Разработка модели реологии тканей
Для сравнения локального стресса и локальной вирулентности была создана модель исследования реологии тканей. Однако оболочка чипа не позволяет использовать реологические зонды, а PDMS-скаффолд изменяет механическое поведение по сравнению с командой насоса давления. Поэтому для решения этих проблем была разработана надежная математическая модель, основанная на анализе видеозаписей.
Динамическое вторжение s. flexneri
Для изучения динамики инфицирования S. flexneri исследователи вели наблюдение в течение 1-2 часов после инфицирования, сравнивая результаты с авирулентным штаммом (Shigella-mxiD). Они наблюдали за двумя ключевыми параметрами: масштабами бактериальных колоний и индивидуальной продолжительностью проникновения.
Перистальтика усиливает бактериальную колонизацию, начинается раньше и расходуется быстрее
Действительно, количество бактерий значительно увеличивается при перистальтическом движении (рис. 5А). Кроме того, в течение первых 2 часов после заражения активация TSAR проходит через две различные фазы, демонстрируя более раннюю и более обширную индукцию вирулентности при перистальтике (рис. 5B).
Рисунок 5. Инвазия тканей S. flexneri. А) Количество бактерий в растущих колониях (N=8), Б) Примерные кривые количества TSAR-активированных бактерий как маркера их системы секреции (N=4).
Локальный механический стресс ускоряет распространение от клетки к клетке
Влияние локального механического стресса на S. flexneri изучалось путем сравнения скорости активации TSAR у отдельных бактерий. Для этого с помощью синего мембранного зонда Pro12A были составлены карты напряжений в ткани и сравнены с активацией TSAR у отдельных бактерий. Как показано на рис. 6, бактерии значительно раньше активируются в областях повышенного эпителиального стресса.
Рисунок 6. Карта напряжения (усредненная за цикл) с наложенным временем активации TSAR; каждая точка соответствует (x, y) координатам отслеживаемой активации (чем темнее, тем быстрее время активации)
Динамическая инвазия e. histolytica
Для исследования инфекции E. histolytica использовался строгий 7-часовой период наблюдения с 30-минутными или 1-часовыми интервалами, в отличие от контроля с использованием ингибитора цистеиновой протеазы (E64), который предотвращает деградацию клеток. Наблюдались три важнейших параметра: гибель клеток, связность тканей и проникновение патогенов.
Перистальтика усиливает деградацию амебоидной ткани и инвазию тканей
С помощью флуоресцентной микроскопии было отмечено 10-процентное увеличение смертности при перистальтике (WP) через 3 часа после заражения амебоидной ткани по сравнению со статичной тканью (WOP, рис. 7A). Для устранения нарушения ткани также наблюдали за связью клеток, которая достигала предела примерно через 3-4 часа после заражения (рис. 7B).
Рисунок 7. Деструкция тканей в условиях перистальтики после заражения амебоидной инфекцией. А) Процентное соотношение мертвых клеток к общему количеству мертвых клеток (N=8). Оценка связности ткани на основе E-кадхериновых стыков (N=6).
Процесс деградации ткани также наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 8). Вкратце, E. histolytica (красный) деградировала актин (фиолетовый) на щеточной кайме, фагоцитировала мертвые клетки (желтый) и расщепляла E-кадхериновые (зеленый) соединения в процессе инфекции. Перистальтические движения активно способствуют этому механизму, подчеркивая тесную связь между механизмами инфекции и механикой ткани, как выяснилось в данном исследовании.
Рисунок 8. Деструкция тканей и процесс инвазии при амебоидной инфекции через 1 и 3 часа. Красный: амеба; фиолетовый: актин; зеленый: E-кадхерин; желтый: мертвые клетки (масштабная линейка 20 мкм).
Цистеиновые протеазы, секретируемые E. histolytica, необходимы для эффективной деградации и инвазии в ткани толстой кишки человека. В условиях экспериментального чипа с ингибитором цистеиновых протеаз (E64) деградации ткани и инвазии паразита не наблюдалось, WP и WOP (рис. 9). Это подчеркивает важную роль активности цистеиновых протеаз в эффективном разрушении и инвазии тканей, подтверждая, что OoC является точной моделью для изучения начальных этапов развития амебиаза.
Рисунок 9. Конфокальный z-стек, 7 часов после заражения амебой. Слева - без ингибитора цистеиновой протеазы, справа - с ингибитором цистеиновой протеазы (E64), вверху - с перистальтическим движением, внизу - без перистальтического движения.
Локальное механическое напряжение усиливает проникновение амебоидов
В итоге было установлено, что перистальтика снижает миграцию амеб по эпителию по сравнению с условиями без перистальтики, тем самым облегчая проникновение в ткани. При сравнении скорости проникновения отдельных амеб с уровнем локального стресса с помощью того же метода корреляции с локальным стрессом было обнаружено, что паразиты были статистически более успешными в областях, испытывающих более высокий стресс, вызванный перистальтическим движением.
Заключение
Перистальтика играет роль в обновлении тканей кишечника за счет отторжения эпителиальных клеток и микробиоты. Подавление моторики желудочно-кишечного тракта обычно способствует избыточному росту бактерий, что свидетельствует о том, что перистальтические движения имеют принципиальное значение для минимизации риска инфекции. Тем не менее, полученные данные свидетельствуют о том, что перистальтические движения служат определяющим фактором для инвазии как S. flexneri, так и E. histolytica, несмотря на существенные различия в размерах, жизненном цикле и механизмах инфицирования. Эти патогены эволюционировали, чтобы использовать экологические сигналы толстой кишки, что предполагает переоценку того, как мы исследуем взаимодействие хозяина и патогена в нише их органов-мишеней. Обзор влияния перистальтических движений и локального механического напряжения при инфицировании двумя патогенами представлен на рис. 10.
Рисунок 10. Влияние перистальтического движения и локального механического напряжения на стратегию инвазии для S. flexneri и E. histolytica. Создано с помощью программы Biorender.
