Вызовы
В последнем отчете Всемирной Организации Здравоохранения четыре из десяти угроз для глобального здравоохранения в 2019 году были связаны с вирусами. Поиск эффективных способов лечения и ликвидации вирусных заболеваний может быть улучшен путем исследования структуры частиц, механизмов заражения и целенаправленного воздействия лекарственными препаратами на вирусные частицы и инфицированные клетки-хозяева.
Одной из самых больших проблем в понимании вирусных взаимодействий является небольшой размер вирусных частиц в диапазоне от нескольких микрометров до нанометров, которые часто появляются как дифракционно-ограниченные пятна в обычных световых микроскопах. До недавнего времени электронная микроскопия была методом выбора для исследования вирусных частиц, но высокая стоимость и сложная пробоподготовка ограничивают преимущества такой методики.
Микроскоп Nanoimager, благодаря своим возможностям визуализации dSTORM микроскопии, может эффективно решать эту проблема путем визуализации вирусных частиц и их содержимого на уровне одной молекулы. Вирусные частицы можно визуализировать в растворе и в клетках-хозяевах, используя до четырех лазерных линий, предоставляя очень гибкие варианты маркировки образцов.
Результаты
Микроскоп Nanoimager - это микроскоп сверхвысокого разрешения, позволяющий визуализировать флуоресцентные молекулы в образцах, меченных четырьмя (максимум) разными флуорофорами, визуализируя два из них одновременно. Ниже представлена организация молекул на мембране и внутри реконструированной частицы ВИЧ, прилипшей к покровному стеклу. В этом эксперименте (рис. 1А) поверхностный гликопротеин (пурпурный) и клеточные факторы хозяина (голубой), включенные в реконструированные частицы ВИЧ были исследованы с использованием визуализации методом dSTORM микроскопии с разрешением до 20 нм. Такая информация не может быть получена с использованием обычных флуоресцентных широкопольных микроскопов (вставка в рис. 1А). Размер обнаруженной одиночной вирусной частицы составил около 190 нм, и распределение клеточного фактора хозяина, накопленное внутри частицы, анализировали с помощью специального программного обеспечения NimOS (рис. 1B).
Рисунок 1: Восстановленное изображение частицы ВИЧ, полученное dSTORM микроскопией с помощью микроскопа Nanoimager. (A и B) Данные показывают пространственную организацию поверхностных гликопротеинов и включенных клеточных факторов хозяина в частицу, меченную антителами, конъюгированными с AF647 (окрашены в пурпурный цвет) и AF488 (окрашены в голубой цвет), соответственно. Вставка в A: широкопольное изображение вирусной частицы, ограниченное дифракцией. Масштабная линейка 50 нм. Образец, подготовленный лабораторией доктора Г. Меликяна, Университет Эмори, Атланта, США.
Во втором эксперименте была проверена геометрия нуклеокапсидоподобных сборок вируса Марбурга в клетках гепатомы человека (HuH-7) (Рис. 2). Ширина нуклеокапсидной нити внутри субвирусной частицы составляла около 105 нм (вставка в рис. 2А). Эти данные также выявили, что структурная ориентация нуклеокапсида имеет форму штопора (рис. 2B), что согласуется с предыдущими отчетами с использованием cryoEM (Bharat et al., 2012).
Рисунок 2: Нуклеопротеин вируса Марбург был экспрессирован в клетках гепатомы человека (HuH-7) и помечен AF647 и визуализирован dSTORM микроскопией с использованием буфера BCubed. Образец был предоставлен профессором С. Беккер, д-р О. Дольник и д-р К. Грикшайт и командой из Марбургского университета.
Решение с Nanoimager
Микроскоп Nanoimager предлагает пользователю различные режимы работы, включая dSTORM, PALM, smFRET и поддерживает режимы освещения от эпифлуоресценции до TIRF. Благодаря такому ассортименту методов микроскопии в одном устройстве стало проще, чем когда-либо, получить максимальную отдачу от флуоресцентной микроскопии как при визуализации фиксированных образцов, окрашенных по протоколам иммунофлуоресценции, так и во время визуализации живых клеток.
Микроскоп Nanoimager предоставляет комплексное решение для лучшей разработки диагностических инструментов, вакцин и противовирусных препаратов, делая исследования инфекционных возбудителей простыми и доступными для всех. Кроме того, его компактный размер и непревзойденная стабильность делают его основным выбором для кабинетов безопасности BSL3 и биобезопасных лабораторий BSL4.
Выводы
Микроскоп Nanoimager позволяет осуществлять визуализацию и количественную оценку вирусных частиц на уровне одной молекулы. Этот тип исследований поддерживает оценку:
- Размер и характеристика вируса, чтобы лучше понять инфекционные жизненные циклы агентов;
- Содержание и распределение частиц;
- Понимание инфекционных механизмов;
- Распространение вируса на хозяине;
- Разработка новых диагностических инструментов и лечебных препаратов;
- Исследования вакцин и развитие профилактики болезней.