Арт. Digidata 1550B
Ионные каналы
Ионный канал — это группа белков, которые образуют поры в липидном бислое клетки. Каждый канал проницаем для определенного иона (примеры: калий, натрий, кальций, хлорид). Патч-кламп используется для оценки тока или напряжения в мембране, связанного с активностью ионных каналов. Измерения производятся путем прямого измерения в реальном времени с использованием сверхчувствительных усилителей, высококачественных систем сбора данных и мощного программного обеспечения для оценки результатов.
Анализ процессов в клетках
Ионные каналы участвуют во многих процессах в клетке, и понимание функции ионных каналов в ответ на изменения мембранного потенциала или присутствие или отсутствие других молекул важно для точного понимания того, как ионные каналы участвуют в нормальных и аномальных биологических процессах, таких как дифференциация и миграция, болезненные состояния и нейронные коммуникации.
Патч-кламп
Метод патч-клампа использует стеклянную микропипетку, образующую плотное гигаомное соединение (ГОм) с клеточной мембраной. Микропипетка содержит проволоку, погруженную в электролитический раствор для проведения ионов. Отграниченный пипеткой фрагмент мембраны и называется «патч» — «фрагмент», слово «кламп» в названии метода можно интерпретировать и как захват и изоляцию этого фрагмента, также как и фиксацию трансмембранного потенциала в изолированном фрагменте, или, как будет описано позже, потенциала или тока на целой клетке. Методика работы с целой клеткой включает разрыв участка мембраны с помощью мягкого отсасывания для обеспечения электрического доступа с низким сопротивлением, позволяющего контролировать трансмембранное напряжение. В качестве альтернативы исследователи могут оторвать участок мембраны от клетки и оценить токи через отдельные каналы с помощью техники патч-кламп наизнанку (inside-out, изнутри наружу) или конфигурации, при которой внешняя часть клеточной мембраны оказывается с внешней стороны микроэлектрода (outside-out).
Фиксация тока
Когда изучаются изменения проводимости однотипных каналов в ответ на какие-то химические воздействия или зависимость их проводимости от разности потенциалов на мембране, удобно фиксировать потенциал и измерять ток канала. Этот вариант патч-кламп, называется фиксацией потенциала (voltage clamp). Однако, иногда исследователя интересуют процессы трансмембранного переноса ионов, связанные с изменением мембранного потенциала — например, проведение нервного импульса. В таких случаях можно зафиксировать на постоянном уровне ток, и изучать изменения разности потенциалов. Такой вариант называется фиксацией тока (current clamp).
Для измерения мембранного потенциала приборы MultiClamp 700B и Axoclamp 900A контролируют падение напряжения, вызванное подачей тока через последовательно включенный резистор. Фиксация ока обычно используется для введения смоделированных, но реалистичных сигналов тока в клетку и мониторинга мембранного эффекта. Этот метод идеально подходит для оценки важных клеточных событий, таких как потенциалы действия.
Фиксация напряжения (потенциала)
В эксперименте с использованием метода фиксации напряжения исследователь контролирует мембранное напряжение в клетке и измеряет трансмембранный ток, необходимый для поддержания этого напряжения. Такое управление напряжением называется командным напряжением. Чтобы поддерживать этот уровень командного напряжения, усилитель должен подавать ток. Подаваемый ток будет равен и противоположен току, выходящему через открытые ионные каналы, что позволяет усилителю измерять величину тока, проходящего через открытые мембраносвязанные ионные каналы.
Последовательная компенсация сопротивления
Последовательное сопротивление представляет собой сумму всех сопротивлений между усилителем и внутренней частью клетки с использованием метода работы с целой клеткой. Согласно закону Ома, чем больше это сопротивление, тем больше разница между уровнем командного напряжения и измеренными значениями. Это создает ошибку в фактическом измерении напряжения или тока, что потенциально может привести к неточным измерениям. Чтобы преодолеть эту проблему, усилители Molecular Devices имеют встроенную схему для улучшения полосы пропускания записи путем компенсации ошибки, вносимой падением напряжения или тока на последовательном сопротивлении.
Одноканальная запись
Метод патч-клампа использует стеклянную микропипетку, образующую плотное гигаомное соединение с клеточной мембраной. Микропипетка содержит проволоку, погруженную в электролитический раствор для проведения ионов. Для измерения одиночных ионных каналов «участок» мембраны отрывается от клетки после формирования гигаомной изоляции. Если внутри такого «участка» имеется один ионный канал, можно измерить токи. Axopatch 200B с чрезвычайно низким уровнем шума идеально подходит для этого применения, максимизируя сигнал для ионных каналов с наименьшей проводимостью.
Патч-кламп при работе с целой клеткой
Методика цельноклеточного патч-клампа включает использование стеклянной микропипетки, образующей плотное гигаомное (ГОм) соединение с клеточной мембраной. Эта микропипетка содержит проволоку, погруженную в электролитический раствор для проведения ионов. Участок мембраны впоследствии разрывается путем мягкого отсасывания, так что стеклянная микропипетка обеспечивает доступ ко всей клетке с низким сопротивлением, тем самым позволяя исследователю контролировать трансмембранное напряжение и оценивать сумму всех токов через мембраносвязанные ионные каналы.
Сбор данных
Сигнал тока или напряжения, получаемый усилителем, является аналоговым сигналом, но для выполнения анализа данных, необходимого для измерений с высоким разрешением, аналоговый сигнал необходимо преобразовать в цифровой. Расположенный между усилителем и компьютером, АЦП выполняет эту важную задачу. Качество сигнала чрезвычайно важно и зависит от частоты дискретизации. Последнее поколение АЦП Digidata осуществляет выборку с частотой 500 кГц и может быть оснащено системой HumSilencer, которая устраняет линейный шум 50/60 Гц.
Исследования болезней
Ионные каналы играют роль во многих заболеваниях, включая гипертонию, сердечные аритмии, желудочно-кишечные, иммунные и нервно-мышечные расстройства, патологическую боль и рак. Понимая точную роль ионных каналов при конкретном заболевании, исследователи, возможно, смогут найти способ повлиять на ионный канал таким образом, чтобы изменить течение заболевания.
