Конфокальная микроскопия предлагает несколько преимуществ по сравнению с обычной оптической микроскопией, включая контролируемую глубину резкости, устранение излучения от областей образца вне фокуса и возможность регистрации серий изображений - оптических срезов толстых образцов. В биомедицинских науках основное применение конфокальной микроскопии включает визуализацию либо фиксированных, либо живых клеток и тканей, которые обычно маркированы одним или несколькими флуоресцентными зондами.
Рис. 1 Основные световые пути в конфокальной микроскопии
Когда получают изображения флуоресцирующих образцов с помощью обычного широкопольного оптического микроскопа, вторичная флуоресценция, испускаемая образцом, которая появляется вдали от интересующей области, часто ухудшает разрешение изображения тех объектов, которые находятся в фокусе.
Такая ситуация особенно проблематична для образцов, имеющих толщину более 2 микрометров. Метод конфокальной визуализации обеспечивает незначительное улучшение как осевого, так и поперечного разрешения, но способность конфокальной системы исключать из изображения свет от областей толстого образца, находящихся «не в фокусе», вызвало настоящий взрыв популярности данной техники. Большинство современных конфокальных микроскопов относительно просты в эксплуатации и стали частью основных инструментов многих многопользовательских средств визуализации.
Поскольку разрешение возможное в лазерном сканирующем конфокальном микроскопе (LSCM) несколько лучше, чем в обычном широкопольном оптическом микроскопе, но все же значительно меньше, чем в трансмиссионном электронном микроскопе, он в некотором смысле занял нишу между двумя наиболее часто используемыми методами. На рисунке 1 показаны основные пути прохождения света в базовой конфигурации конфокального микроскопа.
В обычном широкопольном микроскопе весь образец купается в свете от ртутного или ксенонового источника, и изображение можно увидеть непосредственно глазом или оно может быть спроецировано непосредственно на устройство захвата изображения или фотопленку. В отличие от данной техники, метод формирования изображения в конфокальном микроскопе принципиально отличается. Освещение достигается путем сканирования образца одним или несколькими сфокусированными лучами света, обычно от лазера (рис. 2). Изображения, полученные сканированием образца таким способом, называются оптическими срезами. Эта терминология относится к неинвазивному методу, с помощью которого прибор собирает изображения, используя сфокусированный свет, а не физические средства для разделения образца.
Рис.2 Широкополосное vs точечное сканирование образцов
Конфокальный подход значительно облегчил визуализацию живых образцов, позволил автоматизировать сбор трехмерных данных (серия срезов по оси z) и улучшил изображения, полученные от образцов с несколькими метками. На рис. 3 представлено сравнение обычного эпифлуоресцентного изображения с конфокальным изображением похожих областей эпителия крыльев куколки, окрашенного йодидом пропидия. Существует резкое улучшение разрешения ядер в изображении, полученном методом LSCM благодаря устранению сигнала флуоресценции от области образца "вне фокуса".
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (LSCM) в настоящее время является наиболее широко используемым вариантом конфокальной системы для биомедицинских исследований. В этом введении акцент делается на LSCM, так как данная статья больше предназначена для начинающих пользователей. Другие альтернативные конструкции таких систем предпочтительны в определенных нишах в области биологической визуализации. Большинство протоколов для подготовки образцов могут использоваться с незначительной модификацией для любого из вариантов конфокальных систем, а также для других методологий получения оптических срезов, таких как методы деконволюции и многофотонная визуализация.
Эволюция конфокальной микроскопии
Изобретение конфокального микроскопа обычно приписывают Марвину Мински, который создал рабочий микроскоп в 1955 году. Развитие конфокального подхода было в значительной степени обусловлено желанием визуализировать биологические события, происходящие в живой ткани (in vivo), у Мински была цель визуализировать нейронные сети в неокрашенных препаратах живого мозга. Принцип конфокальной визуализации, разработанный Мински и запатентованный в 1957 году, применяется во всех современных конфокальных микроскопах. Рисунок 1 иллюстрирует принцип работы конфокальной системы, применяемый в эпифлуоресцентной микроскопии, данная конфигурация стала базовой для большинства современных конфокальных систем, используемых для флуоресцентной визуализации. В первоначальной конфигурации Мински в качестве точечного источника света использовалась точечная диафрагма, расположенная перед источником циркониевой дуги.
Рис. 3 Эпителий крыла бабочки
Точечный источник света фокусировался линзой в желаемой фокальной плоскости в образце, а свет, прошедший через нее, фокусировался второй линзой на втором точечном отверстии, имеющем тот же фокус, что и первая точечная диафрагма (оба были конфокальными).
Любой свет, прошедший через второе отверстие, попадает на малошумящий фотоумножитель, который генерирует сигнал, связанный с яркостью света от образца. Второе отверстие препятствовало попаданию света от плоскостей сверху или снизу от плоскости фокуса в образце, к фотоумножителю. Использование пространственной фильтрации для устранения расфокусированного света или бликов в образцах, которые толще плоскости фокусировки, является основной концепцией конфокального подхода. В работах Мински он также описал модель микроскопа с отраженным светом, в которой использовалась одна линза и дихроичное зеркало. Она и стала основой для используемых в настоящее время систем.
Чтобы построить изображение с использованием конфокального принципа, сфокусированное пятно света должно сканировать образец каким-либо образом. В оригинальном инструменте, построенном Мински, луч был неподвижен, а сам образец перемещался на платформе. Преимущество такой системы состоит в том, что сканирующий луч удерживается неподвижно на оптической оси микроскопа, что может нивелировать большинство дефектов линз, которые могут повлиять на изображение. Однако для биологических образцов движение может вызвать колебания и искажения, что приведет к потере разрешения изображения. Кроме того, невозможно выполнять различные манипуляции с образцом, такие как микроинъекция флуоресцентно меченных зондов, когда платформа и образец движутся.
Независимо от того, каким образом луч сканирует образец, должно быть получено изображение. В оригинальном дизайне Мински реальное изображение не было сформировано, вместо этого выходной сигнал фотоумножителя был переведен в изображение на экране осциллографа, который не имел функционала для записи. После дебюта своего изобретения Мински позже написал, что качество изображения в его микроскопе было не очень впечатляющим из-за качества дисплея осциллографа, а не из-за плохого разрешения, достигнутого самим микроскопом. Теперь ясно, что отсутствие технологий не позволила Мински в 1955 году полностью продемонстрировать потенциал конфокального подхода, особенно для визуализации биологических структур. Он заявил, что, возможно, это является причиной того, что конфокальная микроскопия не была сразу воспринята биологическим сообществом, которое было и остается очень требовательной группой в отношении качества изображений. В то время у них были световые микроскопы с превосходной оптикой, и они могли легко просматривать и фотографировать свои ярко окрашенные и красочные гистологические срезы ткани на цветной пленке высокого разрешения. В современных конфокальных микроскопах изображение последовательно формируется путем обработки выходного сигнала ФЭУ или захватывается цифровой камерой, включающей устройство с зарядовой связью, непосредственно обрабатывается в компьютерной системе формирования изображений, отображается на видеомониторе высокого разрешения и выводится на бумажном носителе, с выдающимися результатами. Поток информации в современном лазерном сканирующем конфокальном микроскопе изображен на рисунке 4.
Рис.4 Схема информационного потока в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии
Базовая оптика микроскопа оставалась принципиально неизменной в течение десятилетий, потому что конечное разрешение, достигаемое системой, определяется длиной волны света, линзой объектива и свойствами самого образца. Красители, используемые для придания контрастности образцам, и другие технологии, связанные с методами оптической микроскопии, значительно улучшились за последние 20 лет. Рост и совершенствование конфокального подхода является прямым результатом эпохи возрождения в оптической микроскопии, чему в значительной степени способствовали достижения в современных технологиях. Ряд крупных технологических достижений, которые были бы полезны для конфокальной системы, постепенно стали доступными (или более доступными) для биологов и других пользователей микроскопов. Среди них стабильные многоволновые лазеры, улучшенные дихроичные зеркала, чувствительные малошумящие фотодетекторы, быстрые микрокомпьютеры с возможностями обработки изображений и чипами памяти большой емкости, сложные программные пакеты для анализа изображений и видео высокого разрешения, дисплеи и цифровые принтеры изображений.
Эти технологии были разработаны независимо и с 1955 года постепенно включаются в системы конфокальной визуализации. В качестве примера можно привести методы цифровой обработки изображений, впервые они были эффективно применены в начале 1980-х годов исследователями в Океанографическом институте Вудс-Хоул. Используя то, что они называли «микроскопами с улучшенным видеоизображением», они могли получать изображения клеточных структур, таких как микротрубочки, которые находятся за пределами теоретического разрешения оптического микроскопа. Очевидное увеличение разрешения стало возможным благодаря цифровому улучшению изображений, снятых с помощью видеокамеры с усиленным кремнием (SIT) в условиях низкой освещенности, подключенной к цифровому процессору обработки изображений. Клеточные структуры были отображены с использованием оптики с дифференциальным интерференционным контрастом (DIC), а изображения были дополнительно улучшены с использованием методов цифровой обработки.
Классификация конструкций конфокальных микроскопов обычно проводится на основе метода сканирования образцов. Два основных метода сканирования - это движение платформы или луча освещения, и существует по крайней мере два принципиально различных метода сканирования лучом. Первоначальный дизайн Мински представлял собой систему с движущейся платформой, управляемой примитивным камертоном, и создание изображения было довольно медленным. Современные конструкции, использующие метод движущейся платформы, которые развились из оригинальной концепции, в основном используются в приложениях материаловедения, таких как производство микрочипов. Системы, основанные на этом принципе, в последнее время стали популярными в биомедицинских приложениях, включающих скрининг ДНК на микрочипах.
Более практичной альтернативой для визуализации биологических систем является сканирование неподвижного образца лучом освещения. Этот подход является основой многих систем, превратившихся в исследовательские микроскопы. Технические детали, связанные с конфокальной микроскопией, не рассматриваются в этом введении, но в основном используются два принципиально различных метода сканирования лучом; многолучевое сканирование и однолучевое сканирование. Однолучевое сканирование в настоящее время является наиболее популярным, и этот метод используется в лазерной сканирующей микроскопии (LSCM). В данном методе сканирование луча чаще всего осуществляется с помощью зеркал, управляемых гальванометрами со скоростью один кадр в секунду. Для достижения более быстрого сканирования при частоте кадров, близких к видео частоте, некоторые системы используют акустооптическое устройство или колеблющиеся зеркала. Альтернативный метод использует два луча для сканирования в режиме, близком к реальному времени, и обычно основан на использовании вращающегося диска Нипкова. Такие системы были модифицированы из тандем-сканирующего микроскопа (TSM) с доработками, чтобы сделать их более эффективными для сбора изображений флуоресцентно меченных образцов. На рисунке 5 изображена такая усовершенствованная система, в которой используются двойные диски Нипкова и микролинзы для улучшения детектирования низких уровней флуоресценции при сборе изображений в реальном времени.
Рис.5 Конфигурация систем с диском Нипкова
В настоящее время существует два альтернативных метода конфокальной микроскопии, которые используются для получения оптических срезов: деконволюция и многофотонная визуализация. Они отличаются технически, но, как конфокальные методы, основаны на обычном оптическом микроскопе. Деконволюция использует компьютерные алгоритмы для вычисления и удаления информации, находящейся не в фокусе, из флуоресцентных изображений. Благодаря более эффективным алгоритмам и намного более быстрым мини-компьютерам, эта техника стала практичным вариантом для получения изображений. Многофотонная микроскопия использует ту же систему сканирования, что и LSCM, но не требует апертуры отверстия в детекторе. Пинхол не нужен, потому что лазер возбуждает флуорохромную метку только в точке фокусировки, устраняя расфокусированное излучение. Дополнительным преимуществом визуализации живых тканей является то, что фотообесцвечивание в образце уменьшается из-за уменьшенной энергии, поглощаемой лазерным лучом.
Обычный оптический микроскоп формирует основу, вокруг которой строится LSCM. Вместо вольфрамовой или ртутной лампы в качестве источника света используется лазер, который комбинируется с чувствительным фотоэлектронным умножителем (PMT) и компьютером для управления сканирующими зеркалами или другими сканирующими устройствами для облегчения сбора и отображения изображений. После получения изображения данные сохраняются на цифровом носителе и могут анализироваться любым из многочисленных доступных пакетов программного обеспечения для обработки изображений.
По конструкции LSCM освещение и детектирование ограничены одной дифракционно-ограниченной точкой в образце. Освещение фокусируется в образце линзой объектива и сканируется через него с помощью какого-то сканирующего устройства под управлением компьютера. Последовательности точек света от образца детектируются фотоумножителем через отверстие (или, в некоторых случаях, через щель), а выходной сигнал ФЭУ переводится в изображение и отображается компьютером. Хотя неокрашенные образцы можно просматривать с использованием света, отраженного от образца, они обычно маркируются одним или несколькими флуоресцентными зондами.
Один из наиболее коммерчески успешных лазерных сканирующих микроскопов, о котором сообщалось в литературе в 1990 году, был разработан в ответ на сложную фундаментальную проблему, с которой сталкиваются биологи. Многие структуры и специфические макромолекулы внутри иммунофлуоресцентно меченых эмбрионов невозможно отобразить после двухклеточной стадии с помощью обычной эпифлуоресцентной микроскопии, поскольку при увеличении числа клеток общий объем эмбриона остается примерно одинаковым. Это означает, что при увеличении количества плотно упакованных клеток повышенная флуоресценция вне любой интересующей фокальной плоскости влияет на разрешение изображения.
Группа исследователей, работающих над этой проблемой, обнаружила, что ни одна из доступных в то время конфокальных систем не могла удовлетворить их потребности. Технологии того времени состояли из микроскопов со сканирующей платформой, которые создавали изображения слишком медленно, это занимало около 10 секунд для одного изображения, и многолучевых сканирующих инструментов, которые в то время не использовались для флуоресцентной визуализации. Был разработан сканирующий лазерный микроскоп, который подходил для обычной эпифлуоресцентной микроскопии, и наряду с несколькими другими, которые были разработаны в течение того же периода времени, стал предшественником сложных систем, которые теперь доступны для биомедицинского сообщества от нескольких коммерческих поставщиков. Типичный пример доступной в настоящее время системы (Nikon E1000) показан на рисунке 6.
Рис.6 Конфигурация лазерного сканирующего микроскопа
В специализированной системе, которая была разработана, толщину оптических секций можно было варьировать, регулируя диаметр точечного отверстия перед фотоприемником. По сравнению с некоторыми другими конструкциями, в которых используется фиксированный размер отверстия, этот вариант конфигурации гарантирует чрезвычайную гибкость для визуализации биологических структур. Изображение можно увеличивать без потери разрешения, уменьшая площадь сканируемой области и помещая отсканированную информацию в цифровой массив того же размера для хранения или отображения (аналогично изменению увеличения в сканирующем электронном микроскопе). Возможность сделать это гарантирует диапазон увеличения одной объективной линзе и может быть чрезвычайно полезен при визуализации редких или кратковременных событий, которые могут быть пропущены, или в случае потери места при замене линз.
Из-за сложности и гибкости лазерных сканирующих микроскопов доступных в настоящее время у коммерческих поставщиков, в последние годы произошел огромный взрыв популярности конфокальной микроскопии, и многие многопользовательские лаборатории приобретают эти приборы чаще по сравнению с электронными микроскопами. Конфокальная микроскопия имеет преимущество в относительной легкости, с которой могут быть получены чрезвычайно высококачественные изображения образцов, подготовленных для обычной оптической микроскопии, и в ее большом количестве применений во многих областях, представляющих интерес для исследований.
Лазерные сканирующие конфокальные системы первого поколения хорошо работали с неподвижными образцами, но были чрезвычайно неэффективны при использовании световой энергии от лазеров и имели тенденцию убивать живые образцы, если не были приняты особые меры для сохранения их жизнеспособности во время визуализации. Несмотря на ограничения, изображения неподвижных образцов, полученные с помощью микроскопов, были настолько хороши, что специалисты по биологической визуализации полностью приняли конфокальный подход. Технологические доработки были произведены для каждого аспекта процесса визуализации в последующих поколениях инструментов. Кроме того, эргономика и удобство использования новых инструментов значительно улучшены, так что юстировка, изменение комбинаций фильтров и регулировка мощности лазера теперь обычно контролируются программным обеспечением, что намного проще и требует меньше времени. Теперь возможно отображать до трех флуорохромов одновременно и последовательно. Стадия обработки изображений также более развита благодаря усовершенствованному, более надежному программному обеспечению и гораздо более быстрым компьютерам с большим дисковым пространством и оперативной памятью.
