Все ощущения и поведенческие алгоритмы закодированы в динамических моделях активности нейронных сетей. Другими словами, сложные сети из множества отдельных нейронов реагируют на особенности окружающей среды, зрительные или слуховые возбудители, поощрение или наказание и т. д. Нейронные сети распределены в трехмерном пространстве и, в большинстве случаев, пересекают многие корковые слои мозга. Двухфотонная микроскопия позволила нейробиологам достичь глубоких областей мозга (до 850 мкм) и изучить их с высоким пространственно-временным разрешением, используя множество технических решений.
Трехмерная визуализация популяций клеток
Режим анализа: Произвольное поточечное трехмерное сканирование
Несколько тысяч клеток могут быть измерены практически одновременно (30 кГц) с помощью произвольного поточечного трехмерного сканирования за счет ограничения изображения подобластями трехмерного объема, что приводит к сверхвысокой скорости сканирования и отношению сигнал/шум. Программный плагин Cell3DFinder автоматически находит центры клеток в 3D-изображениях и может отображать их в виде набора точек. На рисунках A-D (см. ниже) показаны изменения концентрации Ca2+ в 2000 клетках зрительной коры мыши (GCaMP-экспрессирующей) в зависимости от времени. Публикации: Wertz et al., Science, 2015; Katona et al., Nat Meth, 2012.
Сканирование нескольких сом, распределенных в 3D
Режим анализа: 3D Chessboard scanning с использованием трехмерной коррекции движения
Режим сканирования 3D Chessboard представляет собой расширение произвольного поточечного сканирования, но на плоскости и с использованием технологии коррекции движения, когда произвольные точки анализа расширяются до небольших квадратов за счет смещения лазерного луча. Эти квадраты могут быть расположены где угодно в объеме анализируемого кубического миллиметра, и включают сомы с близлежащей областью. Одновременно можно измерить до 300 сом. Расположение квадратов в шахматном порядке помогает визуализировать сомы, анализировать их активность и корректировать артефакты движения. Видео ниже показывает активность нейронов in vivo, переходные процессы Ca2+ из 100 нейронных сом из области V1 мыши, меченных с помощьюGCaMP6. Публикации: Szalay et al., Neuron, 2016.
Визуализация нескольких сом во время сильного движения
Режим анализа: 3D Multi-cube с использованием трехмерной коррекции движения
Режим сканирования 3D Multi-cube представляет собой пространственно расширенный режим сканирования 3D Chessboard, где вышеописанным квадратам добавляется размерность вдоль оси Z, чтобы охватить всю протяженность сомы, сохраняя, таким образом, всю флуоресцентную информацию даже во время сильных движений с большой амплитудой. Публикации: Szalay et al., Neuron, 2016.
Визуализация редко распределенных интернейронов в 3D в большой нейронной сети
Режим анализа: 3D chessboard scanning в большой нейронной сети
Целые нейронные сети даже из редко распределенных клеток мозга (таких как интернейроны) можно отслеживать в режиме реального времени в трехмерном объеме почти кубического миллиметра с помощью 3D chessboard scanning. В исследовании, представленном на рисунке ниже, активность кальция в почти 250 интернейронах измерялась одновременно в каждом слое гиппокампа СА1 в объеме 800 × 800 × 500 мкм в режиме сканирования в шахматном порядке, в то время как мышь выполняла поведенческие задачи на беговая дорожка. Используя эти записи, молекулярная идентичность изображенных клеток также была определена на основе данных, полученных с помощью постфактум иммуногистохимии. Такого новшества — одновременного определения различных типов интернейронов и динамики их активности в большой нейронной сети — невозможно было бы достичь с помощью традиционных методов записи. Подробнее см.: Geiller et al., Neuron, 2020.
Интервью с одним из авторов
Высокая скорость сканирования со свободой вращения
Режим анализа: Высокоскоростное произвольное сканирование кадров
Клетки, собранные в нейронную сеть, могут быть отсканирвоаны с частотой кадров 40 Гц в поле зрения 500 × 500 мкм (FOV) в режиме высокоскоростного произвольного сканирования кадров микроскопа Atlas от Femtonics. Помимо высокой скорости, еще одним важным и уникальным преимуществом этого режима является то, что выбранную плоскость можно повернуть на любой угол в пространстве. Кроме того, чтобы охватить больше клеток в нейронной сети, плоскость сканирования может быть расширена до элемента объема в качестве альтернативы технологии луча Бесселя, которая позволяет вам следить за действиями сетей в трехмерной ткани. Видео демонстрирует вращение выбранной плоскости в режиме «Высокоскоростной произвольной кадровой развертки». На левой панели показано относительное положение фокальной плоскости объектива синим цветом и фактической двухфотонной фокальной плоскости розовым цветом. Движение розовой плоскости иллюстрирует возможности микроскопа Atlas от Femtonics, который предлагает вам ориентировать плоскость в трехмерной ткани. На правой панели показаны нейроны сети в реальной сканируемой плоскости во время вращения в режиме реального времени.