При выборе источника света для оптогенетики необходимо учитывать два ключевых фактора: требуемую длину волны и интенсивность света.
Во-первых, выбранный вами опсин имеет специфический спектр активации, так что опсин будет активироваться только определенными длинами волн света. Опсин обычно имеет пиковую длину волны, при которой ему потребуется наименьшая мощность, чтобы вызвать ответ. Длины волн, находящиеся дальше от пиковой длины волны, потребуют более мощного выходного сигнала для получения отклика. Поэтому лучше всего выбрать источник света ближе к пиковой длине волны для достижения оптимальной активации. Например, большинство исследователей используют длины волн близкие к 470 нм для активации оптогенетики с ChR2.
Во-вторых, требуемая интенсивность света для вашего эксперимента зависит от поля обзора и выбранного вами опсина. Поле обзора, которое зависит от оптического волокна (для экспериментов in vivo) или объектива микроскопа, оно будет определять, насколько большую область вам нужно покрыть вашим источником света. Опсины имеют порог интенсивности для получения отклика, возникающего в результате освещения. Эти две переменные напрямую связаны, так что для получения отклика требуется оптимальная мощность освещения, а увеличение поля зрения требует большей мощности, поскольку вы должны охватить большую площадь с заданной минимальной интенсивностью.
Теперь, когда вы знаете требования к источнику света для оптогенетики, давайте обсудим два наиболее часто используемых источника света для этого приложения: светодиодные источники света и лазерные источники. Вы можете задаться вопросом, каковы различия между этими источниками света? Какой источник света лучше всего подходит для моего эксперимента по оптогенетике?
Светодиодный источник света
Светодиоды являются основным выбором для оптогенетических экспериментов по множеству причин. Начнем с того, что светодиоды являются недорогими, безопасными для зрения и имеют длительный срок службы, что делает их отличным выбором для любой лаборатории, занимающейся оптогенетикой.
Кроме того, светодиоды бывают в широком диапазоне длин волн (от УФ до ближнего ИК), и поэтому ученые обычно могут найти подходящий светодиод, который наилучшим образом соответствует их выбору опсинов. В зависимости от длины волны, доступная выходная мощность может значительно варьироваться между светодиодами. В видимом диапазоне светодиоды могут производить большое количество энергии, что делает их идеальным решением для большинства оптогенетических экспериментов.
По сравнению с другими типичными источниками света для микроскопии, такими как галогенные или ксеноновые лампы, светодиоды имеют низкую рабочую температуру и не требуют никакого нагрева или охлаждения. Это позволяет легко включать и выключать светодиоды для удобства использования во время экспериментов, а ученые могут легко модулировать интенсивность или использовать импульсные светодиоды, не беспокоясь о их стабильности или повреждении. Кроме того, светодиоды имеют гораздо более длительный срок службы, чем традиционные источники света, и они не требуют частой замены ламп накаливания, что делает их более разумными инвестициями в долгосрочной перспективе.
Важно отметить, что для оптогенетических экспериментов светодиоды могут включаться и выключаться с микросекундным временем для импульсных протоколов. Светодиоды легко запускаются через TTL для синхронизации пульсации с внешним оборудованием.
По сравнению с лазерным источником, светодиоды имеют относительно высокую расходимость, в результате чего мощность светодиода распространяется по всему полю обзора, хотя светодиоды намного лучше, чем традиционные источники света, такие как ртутная или галогенная лампы. В результате светодиоды не идеально подходят для таких применений, как лазерные сканирующие системы, в которых свет должен быть сфокусирован в небольшое пятно, чтобы обеспечить необходимое пространственное разрешение для точечного сканирования по всему полю. Во-вторых, светодиоды, по сравнению с лазерами, также имеют более широкую спектральную полосу пропускания. Это может иметь или не иметь негативное влияние на ваши эксперименты, так как вы можете легко блокировать части спектра светодиода с помощью оптических фильтров. Однако использование оптических фильтров может привести к снижению общей выходной мощности светодиода, так как изначально выходная мощность рассчитывается для всего спектра светодиодного источника света.
Светодиоды подходят для широкого спектра оптогенетических экспериментов. Популярное применение светодиодов - это широкоугольная оптогенетика на базе микроскопа. Светодиоды легко интегрируются в прямые и инвертированные микроскопы и обеспечивают достаточную выходную мощность для стимуляции всех оптогенетических зондов. Кроме того, светодиоды легко синхронизируются с электрофизиологическим оборудованием.
Светодиоды также идеально подходят для свободно-поведенческих экспериментов по оптогенетике, поскольку они могут быть соединены с оптическим волокном, обеспечивая достаточную мощность для таких экспериментов, длительный срок службы и низкую стоимость.
Лазерный источник
Лазеры обычно используются для оптогенетических экспериментов, требующих более высокой интенсивности и/или более точного фокусирования света. Лазеры обеспечивают высокую интенсивность в одном месте, и поэтому они часто используются для лазерного сканирования. По сравнению со светодиодами, лазеры имеют очень узкую спектральную ширину, что позволяет пользователям получать высокую интенсивность на определенной длине волны. Кроме того, лазеры могут быть хорошо коллимированы, чтобы поместиться на микроскопе, или могут быть эффективно соединены с оптическим волокном для оптогенетических экспериментов, требующих высокой оптической мощности.
Хотя лазеры обеспечивают высокую интенсивность для экспериментов оптогенетики, существует целый список их потенциальных недостатков. Сама по себе высокая выходная мощность может быть недостатком для конкретных оптогенетических экспериментов. В частности, для стандартных экспериментов с микроскопами лазеры могут обеспечить слишком большую выходную мощность и вызвать повреждение тканей. Кроме того, для микроскопии луч должен быть расширен, чтобы охватить все поле обзора и должен быть скорректирован для лазерной спекл-структуры.
В отличие от светодиодов, лазеры имеют ограниченную доступность длин волн; они также намного дороже светодиодов и могут потребовать таких мер безопасности для глаз, как блокировка и т. д.
Из-за более высокой эффективности оптической связи лазеры особенно полезны для выполнения оптогенетики на большой площади, как на макроскопе. Лазеры также могут быть использованы для оптогенетических применений in vivo, где может потребоваться высокая интенсивность; однако, большинство светодиодов тоже подходят для оптогенетических применений in vivo.
Где лазеры могут превзойти светодиоды, так это в лазерном сканировании и двухфотонной микроскопии оптогенетических экспериментов, поскольку они могут обеспечить высокую интенсивность в небольшом пятне на более больших длинах волн.
