Фотостимуляция с высоким разрешением
Многофотонная микроскопия является методом выбора для доступа к функциям тканей на клеточном и субклеточном уровнях in vivo. В отличие от однофотонной визуализации, многофотонное возбуждение может проникать глубже в ткань, достигая глубины 1 мм. Система для многофотонной микроскопии FEMTOSmart Dual — это модульное, но доступное решение с многоканальным лазерным возбуждением и многоканальным флуоресцентным детектированием, подходящее для визуализации широкого спектра хромофоров. Основой микроскопов Femtonics является современная оптика и пользовательский интерфейс, который совершенствуется экспертами компании более 10 лет.
Разарретирование (Uncaging) активных компонентов
Свет можно использовать для модуляции функции ткани с высокой пространственно-временной точностью. В первую эру управляемой светом модуляции функции ткани использовался однофотонный источник ультрафиолетового света для высвобождения биологически активных соединений. В течение последних десятилетий 20-го века был разработан широкий спектр соединений в клетке, которые использовались in vitro в экспериментах по uncaging. В 2000 г. было представлено MNI-Glu, первое соединение, подходящее для двухфотонного расщепления (Matsuzaki et al., 2000), которое открыло путь для точного контроля уровней глутамата вплоть до уровня дендритных шипов in vivo. Сегодня uncaging представляет собой форму фармакологии, управляемой светом, где пространственно-временная точность сфокусированного светового луча может ограничивать действие соединения в пространстве и дозе.
Одновременная оптогенетическая активация и флуоресцентная визуализация
Недавно новый способ использования света для доступа к активности нейронов произвел революцию в нейробиологии. Оптогенетика опирается на генетически направленную экспрессию светочувствительных белков, которые могут изменять мембранный потенциал клеток, облучаемых светом (Deisseroth, 2015). Такие белки могут сдвигать мембранный потенциал в сторону деполяризации или гиперполяризации. Несколько приводов имеют оптимизированные варианты с повышенной эффективностью или с красным смещением длин волн возбуждения. И uncaging, и оптогенетика превосходят классические методы модуляции активности, потому что свет может одновременно сообщать об активности многих клеток и модулировать активность множества клеток.
Микроскопы FEMTOSmart Dual со вторым световым путем для фотостимуляции являются доступным выбором для проведения экспериментов по uncaging или оптогенетике. Для полностью оптического доступа к функциям нейронов требуются два независимых лазерных источника и их световые пути, которые Femtonics предлагает в качестве новой системы FEMTOSmart Dual или в качестве обновления существующих систем FEMTOSmart.
Технический обзор двойного светового пути
В системах FEMTOSmart Dual используется дихроичное зеркало для объединения лазерного луча, отраженного обычной гальво-гальво-сканирующей головкой, со вторым лазерным лучом, отраженным гальво-резо-сканирующей головкой. Точно выровненные лучи можно использовать для одновременной визуализации и фотостимуляции в одних и тех же местах образца. В большинстве экспериментальных протоколов гальво-гальво-сканирующая головка используется для прохода по целевым участкам, которые необходимо фотоактивировать, в то время как гальво-резо-сканирующая головка сканирует большую прямоугольную область для записи активности многих клеток, отслеживая эффект фотостимуляции в целом поле зрения. Сканирующая головка гальво-гальво позволяет охватить целевые местоположения, образующие разные паттерны, такие как точки, линии или спирали. Выбор паттерна, используемого для фотостимуляции, связан с природой мишени: точечные пятна подходят для нацеливания на дендритные шипы, линии сканирования могут эффективно покрывать разветвление нейронов, тогда как спирали больше всего подходят для сильной стимуляции клеточных тел. Конфигурации светового пути включают выбор зеркал и фильтров, оптимизированных для uncaging или оптогенетики или любую другую конфигурацию, которая соответствует экспериментальным требованиям наших клиентов.
Преимущества визуализации с одновременной фотостимуляцией с помощью FEMTOSmart Dual
- Истинная одновременность: считывание и модуляция оптической активности реализуются двумя независимыми световыми путями. Один лазерный луч направляется на гальво-гальво-сканирующую головку, в которой используются обычные гальванометрические зеркала для сканирования луча вдоль двух перпендикулярных осей фокальной плоскости. Эта сканирующая головка обеспечивает гибкое позиционирование лазерного луча, благодаря чему траектории сканирования могут охватывать множество мест, где необходимо фотоактивировать клетки или более мелкие элементы. На другом пути света резонансное зеркало гальво-резонансной сканирующей головки обеспечивает быструю визуализацию всего поля зрения с частотой до 31 Гц.
- Гибкая конфигурация: лазерные источники могут быть согласованы с параметрами оптического пути света, которые оптимально подходят для оптогенетики, uncaging или других приложений.
- Интеграция с внешними устройствами: платформа FEMTOSmart была интегрирована в широкий спектр экспериментальных парадигм, работающих с электрофизиологическими установками, поведенческими платформами, установками виртуальной реальности и многими другими.
- Простота использования: моторизованное оборудование, интуитивно понятный и удобный графический пользовательский интерфейс, оптимизированная обработка данных.
ПО для настройки, визуализации и обработки экспериментов по фотостимуляции
Программное обеспечение FEMTOSmart Dual позволяет пользователю выбирать паттерны стимуляции, охватывающие интересующие области, распределенные по полю зрения. Параметры фотостимуляции могут быть установлены в упрощенном интерфейсе для создания полного протокола вашего эксперимента.