Задача
Понимание и количественная оценка поведения вирусных частиц
Вирусные частицы могут сильно различаться по размеру, примерно от 20 нм до 300 нм в диаметре, что в основном меньше (или почти близко) предела оптического разрешения в традиционной флуоресцентной микроскопии. Как следствие, существует множество механистических и функциональных характеристик этих вирусных частиц, которые еще предстоит выяснить. Недавно методы визуализации со сверхвысоким разрешением позволили нам изучить отдельные частицы и их поведение на уровне одной молекулы в живых клетках.
Решение с микроскопом Nanoimager
Отслеживание отдельных частиц
Отслеживание отдельных частиц (SPT – Single-particle tracking) в живых клетках позволяет измерять движение и изменения в поведении флуоресцентно меченых частиц, например, при входе в клетку, попадании в ядро или во время выхода вируса (путем лизиса, экзоцитоза или отпочкования через плазматическую мембрану). Микроскоп Nanoimager позволяет исследователям больше узнать о том, где частицы собираются, накапливаются, временно связываются или куда перемещаются. Кроме того, он позволяет одновременно получать изображения в двух цветах, чтобы легко отслеживать два вида флуорофоров одновременно. Он также имеет Z-замок (фиксацию по оси Z), который облегчает визуализацию в определенной фокальной плоскости, а также поддерживает нагрев всего тела микроскопа и способен работать с оборудованием для микрофлюидики. Для точного измерения воздействия на клетку внешних стимулов,
|
Пример использования
Изучение поведения BHV1 в клетках фибробластов
Видео демонстрирует отслеживание одиночной частицы BHV1 в клетках фибробластов крупного рогатого скота. Отслеживание отдельных частиц обеспечивает пространственно-временную динамическую локализацию вирусных частиц на протяжении их жизненного цикла: сборку и созревание в ядре клетки, оболочку и экзоцитоз в виде зрелых вирионов.
Полученные данные показывают, что отдельные частицы в клетке, приведенные на панели рисунка A, характеризуются более низкими коэффициентами диффузии, чем вирусные частицы внутри клетки. Представленные треки окрашены в соответствии с их коэффициентом диффузии, а вирусные частицы были помечены флуоресцентным белком mCherry. Отслеживание отдельных частиц открыло новое поле возможностей для исследователей, которые сосредоточены на частицах, размеры которых ограничены дифракцией, таких как внеклеточные везикулы, вирусы и внеклеточные частицы. Возможность отслеживать и количественно определять поведение от десятков до тысяч частиц с немедленным доступом к информации даст новое понимание наших знаний об этих ранее плохо охарактеризованных частицах и ускорит процесс открытий в этой области. |
Образец подготовил доктор М. Рихловски, Межвузовский факультет биотехнологии UG & MUG, Гданьск, Польша. |