Арт. DIADEM 1300
Двухфотонная микроскопия: метод визуализации с высоким разрешением in vivo
Двухфотонная микроскопия стала ключевым методом флуоресцентной визуализации, который позволяет in vivo получать неинвазивные трехмерные изображения с субмикронным разрешением по объему. В связи с более широким спектром применений, особенно в области нейробиологии, двухфотонная микроскопия привела к созданию систем с использованием новых методов возбуждения и инновационных лазерных источников.
Почему фемтосекундные лазеры?
Многофотонное возбуждение требует высокой пиковой мощности, и фемтосекундные лазеры стали оптимальным решением из-за их относительно низкой плотности потока энергии, ограничивающей повреждение живых образцов. Лазеры Ti:Sapphire с перестраиваемой длиной волны удовлетворяют этому требованию и широко используются в биофотонике. Это привело к стандартным методам, использующим обычный импульсный режим с типичной длительностью импульса 100–150 фс, частотой повторения 80 МГц и средней мощностью на уровне ватт с определенными длинами волн, такими как 800 нм, 920 нм и 1040–1080 нм.
Разнообразие импульсных характеристик новых фемтосекундных лазеров
Недавние технологические разработки привели к коммерческой доступности новых поколений фемтосекундных лазеров, способных предлагать более широкий спектр импульсных режимов. Фемтосекундные лазеры на основе оптических параметрических усилителей чирпированных импульсов (OPCPA) предлагают широчайший диапазон импульсных режимов, способных работать с низкой и выбираемой частотой повторения, на уровне мкДж и охватывая широкий диапазон длин волн от ближнего инфракрасного до инфракрасного. Хотя системы на основе OPCPA обладают высокой универсальностью, они громоздки, дороги, не так надежны и стабильны, как обычные лазеры.
В качестве альтернативы фемтосекундные лазеры с фиксированной длиной волны оказались хорошим компромиссом для микроскопии с двухфотонным возбуждением. Их основные преимущества заключаются в низкой цене, очень компактном и прочном формате, высоком электрическом КПД и высокой надежности. Это новое поколение лазеров, доступных в диапазоне длин волн 780 нм, 920 нм и в диапазоне длин волн 1030-1070 нм, изначально было задумано, чтобы соответствовать стандартным импульсным режимам Ti:Sapphire лазеров, чтобы заменить или дополнить это решение. Фемтосекундные лазеры с фиксированной длиной волны теперь предлагают альтернативные импульсные режимы, недоступные для Ti:Sapphire лазеров, такие как различные частоты повторения, более высокая средняя мощность и более высокая энергия, что делает их идеальными кандидатами для расширения границ современных исследований. Тем не менее, при таком большом разнообразии фемтосекундных лазеров выбор адекватного лазерного решения, подходящего для данного приложения, становится сложной задачей.
Параметры лазера для многофотонного возбуждения
Далее мы рассмотрим, как характеристики лазерного импульса влияют на процессы многофотонного возбуждения.
Микроскопия с многофотонным возбуждением основана на нелинейных оптических процессах, происходящих в живых образцах, генерирующих локализованную флуоресценцию, которая будет выборочно обнаруживаться для получения изображения. Оптические нелинейности напрямую связаны со свойствами лазерного импульса, поскольку для усиления нелинейных эффектов в образцах, в данном случае биологических материалах, требуется высокая интенсивность света.
Высокая интенсивность достигается за счет фокусировки лазерного луча до размера пятна в микрометровом диапазоне. Задача состоит в том, чтобы получить многофотонное возбуждение флуоресценции глубоко в образце, где поглощение и рассеяние воды значительны. Хотя хорошо известно, что способность к фокусировке обеспечивается объективами микроскопа с низкой аберрацией и высокой числовой апертурой в сочетании с адекватными размерами лазерного луча, выбор длины волны возбуждения также важен, поскольку более короткая длина волны приведет к более высоким потерям рассеяния. Также необходимо учитывать поглощение воды для более глубокого изображения биологического образца. Предполагая, что все пространственные и спектральные характеристики лазерного луча сохранены и оптимизированы, необходимо учитывать реальный импульсный режим для максимизации эффективности многофотонного возбуждения.
Параметры импульса для многофотонного возбуждения
Как только нелинейная флуоресценция создается с помощью остро сфокусированного лазерного луча, параметры лазерного импульса должны быть оптимизированы для дальнейшего улучшения качества визуализации. Если рассматривать только импульсные характеристики, то флуоресценция многофотонного возбуждения 
напрямую зависит от средней мощности 
и пиковой мощности 
:
По сути, флуоресценция пропорциональна средней мощности для данной пиковой мощности. Пиковая мощность связана с длительностью импульса 
и энергией импульса 
следующим образом:
Это означает, что для данной энергии импульса более короткая длительность импульса приведет к увеличению пиковой мощности. Это объясняет, почему фемтосекундные источники обычно используются в многофотонных процессах. Нелинейная флуоресценция теперь может быть выражена как функция энергии и длительности импульса:
Это выражение показывает, что выбор самой короткой длительности импульса улучшит флуоресценцию, поскольку флуоресценция пропорциональна 
.
Компенсация дисперсии групповой задержки
Некоторые коммерческие лазеры могут генерировать импульсы длительностью <10 фс, что теоретически увеличивает флуоресценцию более чем в 10 раз по сравнению с обычной длительностью импульса 100 фс. На самом деле эта теория ограничена дисперсией, создаваемой всей оптикой, составляющей микроскопическую систему. При длительности импульса более 70 фс дисперсия групповой задержки (GDD) оптических элементов может быть предварительно скомпенсирована обычными дисперсионными элементами, такими как призмы, которые часто используются в передовых лазерных источниках. Это обеспечивает сохранение качества импульса на образце. Однако для импульсов длительностью <70 пс преобладает дисперсия более высокого порядка, что сильно снижает длительность импульса. Следовательно, лазер с длительностью импульса менее 10 фс на самом деле будет давать гораздо более низкую флуоресценцию по сравнению с лазером с длительностью импульса 100 фс. Вот почему фемтосекундные лазеры, используемые для многофотонного возбуждения, обычно характеризуются длительностью импульса в диапазоне от 80 до 150 фс, где предкомпенсация GDD может быть наиболее эффективной.
Чем больше средняя мощность, тем лучше
Мы рассматривали пиковую мощность как решающий фактор для определения фактора флуоресценции . Энергия также определяется частотой повторения 
и средней мощностью 
:
Это приводит к следующему определению фактора флуоресценции :
Это соотношение показывает, что для лазера с заданной частотой повторения и длительностью импульса флуоресценция возрастает квадратично в зависимости от средней мощности. Ранее мы также выяснили, что оптимальная длительность импульса должна быть больше 70 фс, чтобы избежать более высокой дисперсии, и меньше 150 фс, чтобы сохранить высокую пиковую мощность. При ограниченных возможностях оптимизации длительности импульса средняя мощность становится наиболее важным параметром для увеличения нелинейной флуоресценции.
Ограничения масштабирования мощности лазера в биовизуализации in vivo
Хотя теория показывает, что большая мощность генерирует более высокую флуоресценцию многофотонного возбуждения, это также может вызвать фотообесцвечивание или потенциально повредить живые образцы. Это значительно ограничивает использование более высокой средней мощности в системах микроскопии in vivo. Если слишком большая оптическая мощность может повредить одно пятно, то это дает возможность возбуждать несколько участков с четко определенными уровнями мощности на каждом участке. Эта стратегия используется сегодня несколькими лабораториями, что подталкивает к необходимости фемтосекундных лазеров, производящих все более и более высокую среднюю мощность.
Как изменение частоты повторений может помочь
Поскольку высокая средняя мощность может повредить живые биологические образцы, можно повысить эффективность флуоресценции, сохранив среднюю мощность на разумном уровне, уменьшив частоту повторения. Эту возможность предлагают новые лазеры с фиксированной длиной волны, а также лазеры на основе OPCPA. Снижение частоты повторения дает различные преимущества в многофотонной микроскопии, а также в оптогенетике, где требуется более высокая энергия импульса для возбуждения более широкой популяции нейронов при работе ниже порога повреждения живых клеток.
Лазеры сверхкоротких импульсов Spark Lasers:
- Более высокая средняя мощность на длине волны 920 нм с мировым рекордом 4 Вт компактного фемтосекундного лазера с фиксированной длиной волны (ALCOR 920-4).
- Доступна низкая частота повторения до 30 МГц на ALCOR и до одиночного импульса на других лазерах.
- Управляемая компьютером предварительная компенсация GDD, регулируемая в диапазоне от 0 до -90000 фс², включенная во все лазеры Spark Lasers.
