Арт. Skyra
Научный прогресс зависит от постоянного развития взаимосвязанных отраслей и технологий. Новые системы визуализации высокого разрешения предоставляют исключительные возможности микробиологам, потребности которых побуждают разработчиков оборудования исследовать и идентифицировать системы и компоненты, которые позволят улучшить производительность и удобство использования приборов.
Флуоресцентная микроскопия, в частности, способствовала потрясающим открытиям. Основной вклад в развитие данного метода вносят совершенствования систем хранения данных (современная система 3D визуализации высокого разрешения может генерировать несколько десятков терабайт данных в сутки), камер (от EMCCD сенсоров для работы в условиях низкой освещенности до CMOS камер с высокой скоростью считывания, данные разработки позволяют проводить измерения быстропротекающих процессов и мельчайших структуры в условиях низкой освещенности) и систем освещения.
Обеспечивая более высокую производительность и длительный срок службы, системы освещения на основе светодиодов все чаще заменяют традиционные лампы. Источники суперконтинуума, теперь доступны в коммерческих микроскопах, предоставляя полную свободу выбора длины волны возбуждения.
|
Одночастотные лазеры остаются единственной альтернативой для задач высокоскоростной визуализации высокого разрешения различных образцов, которые требуют большой яркости излучения и высокой точности длины волны. Уже десятилетие данные источники эволюционируют из огромных громоздких газовых лазеров в компактные твердотельные приборы, которые постоянно расширяют рабочий диапазон доступных длин волн и мощностей. Для конечных пользователей, данный прогресс означает не только значительное уменьшение размеров системы, но и более длительный срок службы и сниженные требования к техническому обслуживанию. Разработчики оборудования также могут извлечь выгоду из описанных преимуществ, так как они позволяют не только улучшить характеристики приборов для существующего рынка, но и расширить область интересов своего бизнеса за пределы строго биомедицинских исследований и включить такие приложения как клиническая диагностика и разработка лекарств. Необходимость в надежном оборудовании Два последних приложения обладают высокими требованиями и устанавливают высокую планку для производителей оборудования. Для задач количественного анализа или скрининга, а также клинической диагностики идеальны системы, которые готовы к использованию в автоматическом режиме, обладают интуитивно понятным интерфейсом, компактны, надежны и практически не требуют технического обслуживания. Для получения изображений нескольких образцов одновременно, системы флуоресцентной микроскопии все чаще и чаще оснащают не одним или двумя лазерными источниками, а четырьмя или даже 8 лазерами с определенными длинами волн. |
Пример изображения, полученного методом локализационной микроскопии одиночных молекул (SMLM) на кафедре биотехнологии и биофизики в Вюрцбургском университете имени Юлиуса и Максимилиана. Трехцветное изображение BPAE клетки с красителем mitotracker (красный), актином (бирюзовый) и окрашенным ядром (краситель DAPI, синий). Время регистрации: 4 сек на канал. Разрешение изображения: 2048 × 2048 пикселей. |
Источники, как правило устанавливаются в специальном модуле, откуда свет подается в микроскоп через оптоволокно. Но достигнуть стабильного освещения при использовании света от нескольких источников довольно трубно.
Стандартные модули, объединяющие несколько лазерных источников, соединяют лучи в единый пучок с помощью внешних оптических элементов - такая стратегия увеличивает громоздкость и стоимость системы. Большие размеры затрудняют поддержание термомеханической устойчивости. Данный факт в сочетании с относительно большими оптическими расстояниями означает, что даже небольшие изменения температуры могут привести к отклонениям положения луча. Более того, если отдельный лазерный источник требует обслуживания, то для юстировки системы необходимо вызывать технического специалиста от поставщика, что также затратно. Все это создает препятствие для продвижения передовых медико-биологических технологий за пределы научно-исследовательских учреждений.
Высокоэффективная технология
Совершенствование лазерных технологий борется с данным препятствием путем создания невероятно компактных, не требующих технического обслуживания многоволновых источников. Этот прорыв позволяет поместить все оптические элементы, включая компоненты для изменения формы пучка и юстировки, внутри платформы с терморегуляцией. В результате исключаются проблемы, связанные с юстировкой системы и поддержанием заданных параметров в условиях меняющейся температуры окружающей среды (см. рис.1). Кроме того, это позволяет также устранить трудности в сохранении фокусировки лучей с разными длинами волн в сердцевину SM (одномодового) или PM (поляризационно-стабилизированного) оптоволокна диаметром 3 мкм.
Рис. 1 Одно из преимуществ новых технологий разработки лазеров - обеспечение стабильности выходной мощности излучения во всем спектре длин волн излучения. График демонстрирует превосходную стабильность мощности на выходе оптоволокна на каждой из длин волн при разных температурах основания лазера.
Пример инновационной технологии производства лазеров – это запатентованная технология HTCure от Cobolt. Эта технология названа по методу высокотемпературного отверждения (high-temperature curing). Она основана на процессе высокотемпературной сушки и согласовании коэффициентов теплового расширения платформы и кристаллических материалов, а также компонентов из стекла. Представленная технология обеспечивает ультрастабильное позиционирование высокоточной миниатюрной оптики. С помощью нее был создан лазер Cobolt Skyra, который объединяет 4 длины волны излучения в одном пучке. Вся электроника для запуска, управления и модуляции каждым из источников встроена в корпус, который умещается в ладони. Платформа, на которой собрана оптическая система, термостабилизирована и помещена в герметичный корпус, что в сочетании с короткими расстояниями обеспечивает стабильное позиционирование лазерного луча и надежность в условиях колебания параметров окружающей среды (см. рис. 2)
Рис. 2 Технология HTCure обеспечивает высокую стабильность позиционирования лучей на всех длинах волн. График показывает динамику изменения положения луча при возрастании температуры от 20 до 50°C, в среднем стабильность позиционирования составляет <10 мкрад/°C для всех длин волн.
Совмещая технологии лазеров с диодной накачкой и диодных лазеров, можно получить комбинацию любых длин волн из диапазона от 405 до 660 нм мощностью до 100 мВт. Уникальный процесс производства обеспечивает высокую точность и стабильность перекрытия пучков, которая приводит к высокой (>80%) эффективности сопряжения таких источников с SM/PM оптоволокнами. Модуляция и контроль каждого из источников происходит индивидуально. Доступны функции как аналоговой (до 500 кГц), так и цифровой модуляции (до 5 МГц). При этом лазер не требует отдельных АЦП или генераторов сигнала для модуляции. Для более медленной скорости модуляции (коэффициент заполнения до 1 мс), возможна on / off модуляция отдельных лазерных лучей с помощью ПО. Система сохраняет юстировку даже после транспортировки, что исключает необходимость в дополнительной настройке.
Преимущества
Выгоду от простоты представленной технологии получают как производители, так и исследователи. Компактный (70 × 144 × 38 мм), самонастраивающийся прибор позволяет научным работникам получить источник нескольких длин волн, не занимая большого пространства и практически не требуя затрат на техническое обслуживание. Лазер Cobolt Skyra успешно используется на кафедре биотехнологии и биофизики в Вюрцбургском университете имени Юлиуса и Максимилиана (Гемания) исследователями лаборатории профессора Маркуса Сауера, которые занимаются флуоресцентной микроскопией одиночных молекул и визуализацией, включая микроскопию сверхвысокого разрешения и ее применений в биомедицине. Данная лаборатория стала одним из первых испытателей многоволнового лазера [1]. Источник использовался для локализационной микроскопии одиночных молекул в исследованиях структуры белка в клетках. Полученная система позволяет получить изображения с пространственным разрешением близким к молекулярному. Это дает возможность получить количественные данные (см. рис. 3)
Рис. 3 Преимущества компактного многоволнового лазера в лаборатории: экономия пространства, упрощение систем, отсутствие необходимости в обслуживании. На рисунке представлена система для микроскопии, используемая кафедрой биотехнологии и биофизики в Вюрцбургском университете имени Юлиуса и Максимилиана: микроскоп Nikon TiE, камера Zyla 4.2P, многоволновый лазер Cobolt Skyra и инновационный RCM модуль для конфокальной визуализации.
За последнее десятилетие биологические исследования значительно продвинулись вперед. Возможность получать изображения динамических процессов в структурах и белках на < 150 нм позволила приоткрыть тайну тонкостей субклеточных операций. Исследователям удалось увидеть, как развиваются эмбрионы в 3D и реальном времени, но все же во многом, мы еще только начинаем понимать, как устроена жизнь на микро – и нанобиологических уровнях. Чтобы достичь новых рубежей, ученым необходимы новые технологии. И, как и прежде, каждый из участников развивающейся системы будет способствовать непрерывному процессу эволюции, облегчая и способствуя инновационным исследованиям.
Список литературы
1. M. Sauer and M. Heilemann, Chem. Rev., 117, 7478–7509 (2017); doi:10.1021/acs. chemrev.6b00667.
