Вызовы
Мембранные контакты между клеточными органеллами, например, между эндоплазматическим ретикулумом (ER) и митохондриями, известные как MAMs (митохондриально-ассоциированные ER мембраны), играют решающие роли во внутриклеточной передаче сигналов и метаболических путях. Аномальные изменения при формировании контакта органелл имеет сильную связь с рядом заболеваний, в том числе болезнью Альцгеймера, Паркинсона и двигательных нейронов.
Исследование мест контакта мембран обычно ограничивается визуализацией с помощью фиксированных клеток методом электронной микроскопии, которая не дает представление об их поведении в реальном времени или динамике протекающих процессов. Белки, которые участвуют в образовании МАМ, также обнаруживаются вдоль всей мембраны органеллы, делая специальную маркировку мест контакта затруднительным. Использование микроскопии отслеживания отдельных частиц в реальном времени является решением для исследования мембранных контактов в реальном времени. Благодаря чувствительности к одной молекуле, микроскоп Nanoimager представляет собой доступную и универсальную платформу визуализации для всесторонней характеристики мест мембранных контактов органелл в живых клетках.
Результаты
Микроскоп Nanoimager позволяет визуализировать два флуорофора одновременно, что делает возможным одновременное обнаружение контактно-ассоциированных белков, присутствующих на ER и митохондриальных мембранах. В этом эксперименте (рисунок 1), перемещение одного PDZD8 белка (отмечен красным цветом), молекулярный белок, связывающий ER и митохондрии, было отслежено для изучения потенциальных взаимодействий с белками митохондриальной сети в режиме реального времени (отмечено зеленым цветом).
Текучесть взаимодействия ER-митохондрий была визуализирована и оценена с помощью динамических изменений в контактно-связанных белках PDZD8, когда они приближались к исследуемой митохондрии.
Рис. 1. ER и MAMs (ассоциированные с митохондриями ER-мембраны) белок PDZD8 (HaloTag®-PA, красный) были визуализированы как «идущие» вдоль ER в клетках фибробластов в непосредственной близости от митохондрий (митохондриальный белок слит с GFP, зеленый). Образец предоставлен доктором Xufeng Wu, NIH, Bethesda, США.
Дальнейший анализ диффузии молекул PDZD8 может выявить различия между этими молекулами близко или вообще несвязанными с митохондриями, предоставляя доказательства взаимодействия органелл на участках MAM. Следы перемещения белков PDZD8, снятые в 5-минутном видео, показывают форму сети ER. На рис.2 представлен след белка из данных на рис. 1 (стрелки), наложенных на флуоресцентно меченные митохондрии (зеленые) (рис. 2А, правая часть рисунка). Распределение коэффициента диффузии по всему полю зрения демонстрирует широкий спектр молекулярного поведения, с высокой популяцией, распространяющейся со скоростью примерно 0,08 мкм2/с (рис. 2B).
Рис. 2. Отслеживание белка MAM PDZD8 в клетках фибробластов. (A) Отдельные белковые следы были окрашены в соответствии с их коэффициентами диффузии. Рисунок справа показывает выбранный след, наложенный на широкопольный сигнал флуоресценции из митохондрий (зеленый цвет). (B) График коэффициента диффузии белков PDZD8, отслеживаемых в анализируемой клетке.
Решение с Nanoimager
Понимание механизмов формирования мембранных контактов и дисфункция между ER, а также другими органеллами усиливает разработку лучшего, более точного и своевременного лечения заболеваний, изменяющих жизнь человека. Микроскоп Nanoimager предоставляет комплексное решение для разработки диагностических инструментов и лучшего понимания участков контакта с органеллами в качестве потенциальной терапевтической мишени для возникновения нейродегенеративных заболеваний, включая болезни Альцгеймера, Паркинсона и болезнь двигательных нейронов.
Выводы
Микроскоп Nanoimager позволяет в режиме реального времени визуализировать и дать количественную оценку внутриклеточным изменениям на уровне одной молекулы. Этот тип научных исследований поддерживает изучение:
- Молекулярное содержание MAMs, состав, распространение и поведение;
- Динамические изменения в ассоциациях/диссоциациях контактно-ассоциированных белков;
- Изменения формирования участков мембранных контактов в ответ на стресс условия;
- Разработка инструментов ранней диагностики для нейродегенеративных заболеваний;
- Механизмы, лежащие в основе раннего развития болезни и разработка новых подходов к профилактике заболеваний.